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成果简介
近日，厦门大学环境与生态学院于鑫教授团队在环境领域著名学术期刊Water Research上发表了题为“Dormancy induced by Oxidative Damage during Disinfection Facilitates Conjugation of ARGs through Enhancing Efflux and Oxidative Stress: A Lagging Response”的论文。文章围绕氧化消毒诱导休眠细菌的风险，发现该类细菌能通过滞后反应促进抗生素耐药基因（ARGs）的接合转移。进而，文章从细胞膜通透性、接合转移调节系统、外排泵系统和氧化应激系统4个方面探讨其机理。结果表明，外排系统增强和氧化应激系统激活是该“滞后反应”的主要原因。此外，文章通过比较已报道氧化消毒瞬时效果的相关文献，提出供体细菌的休眠等级是评价其是否能促进ARGs接合转移的关键。该研究对阐明氧化消毒后ARGs的传播潜力和优化消毒工艺具有重要的环境意义。
引言
细菌抗生素耐药性已成为世界性的公共卫生威胁之一。基因突变、水平基因转移（HGT）和垂直基因转移（VGT）构成了三种已知的可富集抗生素耐药性的途径。特别是通过接合、转化和转导作用介导的HGT，已被认为是细菌获得ARGs的最重要策略。消毒作为饮用水和污水处理厂的最后一道工序，在灭活各种病原微生物以实现水的可持续安全方面起着至关重要的作用。在消毒技术中，氯、UV及其组合（UV/氯）因其消毒效率高而被广泛应用和研究。目前，关于消毒对细菌属内ARGs接合转移的影响存在争议，需要进一步系统地解释其相关的机制。此外，以往的研究大多关注消毒对细菌中HGT的瞬时作用，而对这一情况的滞后影响探讨较少。
本研究表明，氧化损伤会引起休眠细菌ARGs接合转移的滞后促进效应。通过凝胶电泳、逆转录实时定量PCR、流式细胞术、透射电镜和厌氧条件下的实验验证等，该工作揭示了可能被忽视的消毒对抗生素耐药性传播的潜在调控机制：细菌通过增强外排和激活氧化应激作用达到提高HGT水平的目的。该研究结果对细菌在受到氧化消毒胁迫后ARGs的传播潜力的评价和完善消毒工艺具有重要意义。
图文导读
图1：UV、氯和UV/氯处理后ARGs接合转移的频率变化。(a-c) 消毒对ARGs接合转移的影响；(d, e) 随机选取接合子中RP4质粒的验证
本研究分别采用UV、氯和UV/氯三种消毒技术处理供体菌（E. coli DH5α），与受体菌（E. coli HB 101）构建LB肉汤体系的接合系统。共孵育24 h后，三种消毒处理下RP4质粒的接合转移频率均被抑制（图1a）。但是，氯和UV/氯处理组在共培养3-7天后，HGT频率分别提高了2.71~5.61倍和5.46~13.96倍，而UV处理组未出现类似结果（图1b和1c），即该现象是一种能促进HGT的“滞后反应”。通过凝胶电泳验证接合子内RP4质粒的存在，排除了该现象抗性表型的可能（图1d和1e）。因此，文章认为氧化损伤会导致休眠细菌ARGs接合转移的滞后促进效应的风险。
图2：不同消毒处理后供体细菌细胞的呼吸活性(a) 和酯酶活性 (b)
通过测量不同消毒处理后细菌的呼吸活性和胞内脂酶活性发现，在HGT频率显著升高的消毒处理组中（氯-30 min和UV/氯-1 min）（图2），细菌的整体代谢活性仍处于较低的水平，即供体细菌仍存在休眠细菌的特征，该观点由其抗逆基因rpoS和ygfA在处理组高表达的结果进一步验证（图S4）。此外，对体系内RP4质粒浓度的绝对定量也发现，氧化消毒后体系内RP4质粒的绝对含量较对照组更低（图S3），说明在该体系中，VGT产生接合子的贡献较小。因此，细菌是处于休眠状态或者至少具备休眠体特征的前提下，主要由HGT的水平提高形成该接合转移的风险。
图3：不同消毒剂 (UV、氯、UV/氯) 对供体E. coli DH5α细胞膜的影响。(a-c)细胞膜通透性；(d-f) 孔蛋白基因 (ompA、ompC和ompF)的表达
文章从4个层面探究该“滞后反应”的机理。（1）细胞膜通透性：通过流式细胞仪的检测结果表明，氧化消毒后细菌细胞膜通透性显著提高（图3a），但在共培养3天和7天后，所有处理组的细菌细胞膜通透性差别不显著（图3b和3c）。这一现象反映了供体细菌在氧化消毒后可能的自我修复过程，通过透射电镜（图3g）和细菌DNA整合/修复基因（nuvA、nuvB和nuvC）的表达结果进一步佐证了细菌可能存在的修复活动。所以，以往文献报道消毒瞬时作用，影响细菌细胞膜通透性并不是本实验中HGT水平提高的主要原因。此外，在对孔蛋白（ompA、ompC和ompF）基因表达的考察中，ompA的表达呈上调趋势（图3d），可能对ARGs的接合转移提供了支持。
（2）接合转移调节系统：RP4质粒的水平转移受到接合转移相关基因的调控，本文对5个接合相关基因，包括整体调节因子（Grg：korA和korB），DNA垂直转移系统（Vts：kilA和kilB）和DNA水平转移系统（Drt：traF）的表达进行了检测。结果表明，所有消毒处理后，Grg和Vts相关基因呈下调趋势，Dtr基因呈上调趋势，均符合ARGs接合转移趋势增加的基因行为（图S6a-S6e），即接合转移相关基因调控是造成“滞后反应”的原因之一。然而，考虑到氧化消毒处理组中，这些基因的表达水平与UV处理组并没有显著的差异，文章认为该系统的相关基因表达对氧化损伤导致的HGT频率升高的调控不起到决定性作用。
图4：不同消毒剂(UV、氯、UV/氯) 处理后体系中外排泵基因(tolC、acrD、macA和ermA)的表达
（3）外排系统：本研究对4个典型外排泵基因（tolC、acrD、macA和ermA）的表达进行了评估。结果表明，氧化消毒处理组中4个基因的表达均显著增强，且与紫外处理组差异显著，其表达量趋势与接合频率最高的氯-30 min和UV/氯-1 min处理组匹配率也很高（图4）。因此，外排作用的增强很可能是加剧HGT的主要原因之一。综合（1）中孔蛋白基因ompA表达上调（图3）结果，结合文献报道孔蛋白基因表达增强可以促进质粒的运输以及外排基因与孔蛋白基因共同表达趋势的联系，文章推测主动外排基因表达上调可能进一步导致孔蛋白的扩大进而再次促进HGT过程。不过，本研究中氧化消毒处理后对孔蛋白调控的深层机制仍不清晰，是今后研究需要进一步解析的重点。
图5：供体细菌（E. coli DH5α）胞内ROS含量 (a-l)。ROS相关调控基因表达(sodA, sodB, sodC) (m-o)
（4）氧化应激系统：由图5可知，氯-30 min和UV/氯-1 min处理组细菌胞内的ROS浓度较高（46.76%和60.28%），这些现象与上述2组的接合转移频率高度一致。氧化应激相关基因（sodA, sodB 和 sodC）表达的结果进一步佐证了该现象。对比文献研究，文章认为在细菌细胞内，ROS直接损伤DNA进而诱导SOS反应，而SOS反应能减少对整合接合元件（integrating conjugative element, ICE）的抑制，从而促进基因的水平转移。文章还通过厌氧条件下的实验验证，提出氧气在该“滞后反应”中的重要性，即厌氧条件下无ROS产生，ARGs的HGT频率并没有显著提高（图6）。所以，氧化应激的激活是该“滞后反应”的另一主要原因。
图6：厌氧条件中ARGs的接合转移现象和相关基因表达。(a) 不同消毒处理后的接合转移频率；(b-g) 不同调控基因表达 (b-d, 接合系统；e, 氧化应激，f, 核酸修复；g, 外排泵)
小结
本研究报道了一个以前被忽视但很重要的现象，即氧化损伤对休眠细菌ARGs接合转移的滞后促进效应。通过比较已报道氧化消毒瞬时效果的文献，结合本研究中细菌的特征，文章推测供体细菌的休眠等级是评价其是否能促进ARGs接合转移的关键。具体结论如下：
（1）氧化消毒可在短期内诱导细菌休眠状态，降低HGT的发生频率，还可能触发细菌的“滞后反应”，显著提高ARGs的接合转移频率。（2）外排增强和氧化应激调节在ARGs的水平传播中起关键作用。（3）供体菌的休眠水平可能是评价其是否能促进HGT的关键。因此，准确划分细菌活性水平和优化消毒剂量对控制水处理中ARGs的增殖和传播尤为重要。
本项目得到了国家自然科学基金委和厦门市科技局的资助。
