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佐治亚理工谢兴团队:局域增强电场处理(LEEFT)实现纳秒级超快细菌灭活

2023-02-09 09:02:09 来源:NW自然水

佐治亚理工学院谢兴教授团队通过局域增强电场处理(Locally enhanced electric field treatment, LEEFT)实现了纳秒级的超快细菌灭活。这一过程中,纳米针电极尖端的电荷聚集效应引发附近的细菌因超快电穿孔而失活。LEEFT打破了传统电场处理灭活细菌的速度限制,大幅降低了所需的电场强度和处理时间,并降低总能量消耗,在水消毒等方向具有很大的应用潜力。

有害细菌的生长繁殖会引起水和食物污染以及致病菌感染等诸多问题,因此,寻找有效的杀菌方法十分必要。常见的杀菌方法,比如使用抗生素或抗菌剂,一般需要几分钟到几小时扰乱细胞正常功能,从而灭活细菌。一些更快的方法,比如使用氯或臭氧等强氧化剂,可在几秒钟内通过氧化杀灭细菌。但是,这些化学杀菌法可能会导致微生物的抗药性或产生有害的副产物。电场处理法(Electric field treatment, EFT)是基于细胞膜电穿孔效应(electroporation)的物理灭菌方法。当细菌置于强电场中时,细胞膜上会出现穿孔,从而实现细菌灭活。传统的电场处理法可以通过毫秒甚至微秒级的电脉冲实现细胞膜电穿孔和细菌灭活,但是更短的纳秒级电脉冲通常被认为无法实现细菌杀灭,因为时间太短不足以使细胞膜完成充电并引发电穿孔。

美国佐治亚理工学院谢兴教授团队在《自然-水》2023年1月刊中报告,通过局域增强电场处理(Locally enhanced electric field treatment, LEEFT)可实现纳秒级的超快细菌灭活,将杀菌所需时间缩短到纳秒级领域。研究团队使用芯片实验室(lab-on-a-chip)作为工具,采用电子束光刻技术在芯片的电极上制作了金纳米针,在单细胞水平对超快灭菌过程进行原位观察与机理探究。研究表明,十个20纳秒40 kV/cm的方波电脉冲(共200纳秒有效处理时间)可在95%的纳米针尖端实现细菌灭活。相较于无纳米针的传统电处理,局域增强电场处理可将施加的电场降低8倍或将处理时间缩短为一百万分之一,从而大幅降低总能量消耗。

研究团队采用电子束光刻技术在芯片的电极上制作了长8微米,尖端宽200纳米的金纳米针。施加电压之前,带负电的模式细菌葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 细胞被均匀固定在芯片表面(图1a),细胞染料SYTOX Green已加入到细胞所处的液体中。COMSOL的模拟结果显示,当电压施加在正负两极时,纳米针尖端附近的电场会大幅增强,此即避雷针效应(图1b)。在施加纳秒级的方波脉冲电后,位于纳米针尖端的细胞膜发生电穿孔,染料便可进入细胞并与DNA结合,显现绿色荧光。20分钟后,再次使用PI染料染色,从而区分已修复的细胞损伤和永久的细胞灭活。仍显示绿色荧光的为受损后自行修复的细胞,显示红色荧光的为灭活细胞。研究还使用细胞内氧化水平和细胞膜过氧化水平等指示剂协助验证杀菌机理,并结合有限元分析的方法对细胞电穿孔过程进行了模拟探究。

LEEFT实现超快细菌灭活

图1. LEEFT实现超快细菌灭活。

(a)细菌固定在带有纳米针的芯片表面。(b)由于避雷针效应在纳米针尖端产生的局域增强电场。(c)施加一个单一的20纳秒55 kV/cm的方波电脉冲后细胞的染色的情况。(d)十个40kV/cm 20纳秒方波电脉冲(共200 纳秒)的细菌灭活情况。  (e)荧光显微镜图(左)与扫描电子显微镜图(右)的对比。(f - h)悬浮在电场中的纳米针仍可导致细菌灭活。

研究表明,在施加一个20纳秒55 kV/cm的方波电脉冲后,27%的纳米针可实现细菌灭活。十个20纳秒40kV/cm方波电脉冲(共200 纳秒有效处理时间)可致使95%的纳米针实现细菌灭活 (图1d)。当纳米针分布于正负两极之间但不与两极相接时,电场仍可在纳米针两端得到增强,从而实现超快速的细菌灭活(图1 f-h)。

在同样使用20纳秒方波脉冲电的情况下,局域增强电场系统相较无纳米针的传统电处理系统在灭菌效果上显示出明显的优势。当施加的脉冲数相同时,在局域增强电场处理中只需施加1/8的电场强度。而当施加的电场强度相同时,局域增强电场可让脉冲数量降低达6个数量级 (图2a & b)。实验数据表明,这种极快的细菌灭活对带有抗药性的细菌具有同等效果,因此在抗性细菌或超级细菌控制领域具有应用潜力。相比于革兰氏阴性细菌,具有更厚的细胞壁的革兰氏阳性细菌反而更容易在局域增强电场处理中被快速杀灭,即使他们在多数其他灭菌方法中更难被灭活(图2 c &d)。

局域增强电场与传统电处理在20纳秒电脉冲下的灭菌效果对比

图2. 局域增强电场与传统电处理在20纳秒电脉冲下的灭菌效果对比。

(a)传统电处理在的灭菌效果。(b)局域增强电场的灭菌效果。(c & d)局域增强电场对抗生素抗性菌和革兰氏阴性大肠杆菌的灭菌效果。

研究进而验证了导致这种超快细菌灭活的主要机理是电穿孔。单细胞水平的原位实验首先证实20纳秒的电脉冲在纳米针尖端引发了可逆电穿孔(图3a)。当电脉冲开启时,细胞内PI染料的荧光强度增加,表明细胞膜穿孔,染料扩散进细胞(图3a黄 色的区域)。当电脉冲暂停时(图3a蓝色的区域),PI的荧光强度立即停止上升,说明细胞膜上的穿孔迅速关闭,细胞膜恢复完整。此现象可重复多次直到细胞最终被灭活。这种迅速的穿孔闭合是电穿孔效应的常见现象,却很难在其他形式的细胞损伤中发生,如氧化或热损伤等。因此证明,局域电场增强处理可实现电穿孔并导致细胞灭活。除此之外,在20纳秒电脉冲处理后,当大于90%的纳米针实现细菌灭活时,并无明显的氧化作用产生,进而排除了细菌灭活是由氧化或自由基导致的可能 (图3 b)。因此电穿孔是主要的机理。

灭菌机理探究

图3. 灭菌机理探究。

(a)20纳秒电脉冲引发的可逆电穿孔。(b)20纳秒电脉冲未引发细胞中的氧化。

结合理论模拟研究,超快细菌电穿孔和灭活机理被进一步揭示。在电场中,细菌的细胞膜如同电容器,可被液体中的带电粒子充电,从而引发电穿孔。由于一般的溶液导电性低,电流小,因而细胞膜充电速度慢,纳秒级的电脉冲很难将细胞膜完全充电。然而,处在金纳米针尖端的细胞由于直接接触或距离纳米针很近,无需依赖水中的带点粒子充电,而是可以直接被纳米针尖端大量聚集的电荷充电。电荷在金属纳米针中的移动速度极快,因此可实现超快的细胞膜充电和电穿孔,从而导致细胞灭活。

超快的细胞电穿孔和杀灭的实现原理

图4 超快的细胞电穿孔和杀灭的实现原理。

LEEFT具有广阔的应用前景。由于其可实现超短脉冲灭菌,且所需电压低,过程安全性高且不易产生电化学反应和副产物,因此可用于处理液体食物、饮用水,或血液等高质量样品。由于纳秒的接触即可杀灭细菌,连续流中的悬浮细菌只要迅速触碰到纳米针尖端即可实现灭活,因此,LEEFT也可被用于连续流反应器中。

同其他非均质过程类似,将目标细胞高效地运送到有效区域,即纳米针尖端,在LEEFT应用中是非常重要的。目前,细胞在LEEFT系统中的运动还未完全揭示。由于电场在纳米针尖端增强,产生了非均匀的强电场,细胞的运动将受到电泳和介电泳的双重效应,并受到电脉冲参数和介质的物化性质等一系列因素的影响。我们还可以通过这些参数来控制细胞的运送,从而实现高效的灭菌过程。因此,细胞在LEEFT系统中的运送将成为我们下一步研究的方向之一。